《Advanced science》是Wiley出版集團旗下的一本開放獲?。∣pen Access）綜合性學術期刊，于2014年創刊。在中科院最新升級版分區表中，大類學科為材料科學1區，小類學科中化學綜合為1區、納米科技為2區、材料科學綜合為1區，屬于TOP期刊?！禔dvanced science》是一本跨學科開放獲取期刊，涵蓋材料科學、物理和化學、醫學和生命科學以及工程學等領域，主要發表這些領域的一流基礎和應用研究成果。

出版周期：12 issues/year；

影響因子：14.1；

ISSN：2198-3844；

發文量：3290篇/年；

審稿速度：平均12周；

版面費：USD 5270.00；

一、研究背景與目標

HCC 是全球致死率最高的癌癥之一，傳統肝切除術后復發率高，而PD-1/PD-L1免疫治療響應率僅 15-30%。其核心瓶頸在于腫瘤微環境（TME）的免疫抑制，尤其是TAMs的異常極化（向M2型轉化）會抑制T細胞功能。本研究旨在探索TAMs中NUPR1的作用及機制。

二、關鍵技術總結

研究通過多種實驗技術解析NUPR1在肝癌腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）中的作用及機制，具體如下：

1、組學分析

單細胞RNA測序（scRNA-seq）：對人及小鼠肝癌組織的單細胞轉錄組數據（GSE149614、GSE232182等數據集）進行整合分析，鑒定NUPR1在TAMs中的特異性高表達，區分NUPR1高/低表達巨噬細胞亞群，并通過基因集富集分析（GSEA）揭示其功能差異（如免疫抑制通路富集）。利用UMAP可視化細胞聚類，結合Harmony算法校正批次效應，確?？鐢祿治龅囊恢隆?o:p>

空間轉錄組（ST）分析：對肝癌組織空間轉錄組數據（GSE238264）進行分析，驗證NUPR1與巨噬細胞標志物CD68 在腫瘤區域的共定位，明確其在腫瘤微環境中的空間分布特征。

bulk RNA-seq與多數據庫整合：整合 TCGA、GEO、ICGC 等數據庫的bulk RNA-seq數據，構建NUPR1?巨噬細胞特征基因集，關聯其表達與患者預后及免疫治療響應

2、巨噬細胞極化和共培養模型

通過腫瘤條件培養基（TCM）誘導THP-1細胞或骨髓來源巨噬細胞（BMDMs）向TAMs極化，結合NUPR1抑制劑（TFP-2HCL、ZZW-115-2HCL）或shRNA敲低技術，研究NUPR1 對巨噬細胞表型的調控

建立巨噬細胞與CD8?T細胞共培養體系，通過流式細胞術檢測T細胞功能標志物（IFN-γ、Gzmb、PD-1），評估NUPR1對T細胞耗竭的影響

3、基因與蛋白水平檢測

定量實時PCR（qRT-PCR）：檢測巨噬細胞中M1/M2 標志物（如iNOS、CD86、CD206、ARG1）及NUPR1、PD-L1等基因的表達水平，驗證NUPR1對極化表型的調控。

Western blotting：分析 ERK、JNK等MAPK通路蛋白的磷酸化水平，以及組蛋白乳酸化（H3K18la）、NUPR1等蛋白表達，揭示分子調控機制。

染色質免疫沉淀（ChIP）：通過ChIP-qPCR驗證乳酸誘導的H3K18la在NUPR1啟動子區域的富集，證實組蛋白乳酸化對NUPR1轉錄的激活作用

4、動物模型與體內實驗技術

皮下移植瘤模型：將Hepa1-6細胞接種于C57BL/6小鼠腋窩，評估NUPR1抑制劑對腫瘤生長、巨噬細胞極化及T細胞浸潤的影響。

原位肝癌模型：通過hydrodynamic尾靜脈注射攜帶c-Myc和Ctnnb-N90質粒的溶液誘導小鼠肝臟自發性腫瘤，模擬更接近臨床的腫瘤微環境。

巨噬細胞轉移實驗：將經TFP-2HCL預處理的BMDMs瘤內注射，驗證靶向巨噬細胞NUPR1對腫瘤生長的抑制作用。

免疫治療聯合實驗：在小鼠模型中聯合使用NUPR1抑制劑（TFP-2HCL或ZZW-115-2HCL）與PD-1單克隆抗體，通過腫瘤體積監測、流式細胞術及IHC染色，評估聯合治療對免疫微環境的改善效果。

5、病理與影像技術

多重免疫熒光（mIF）：檢測腫瘤組織中NUPR1?CD68?巨噬細胞與CD8?T細胞的共定位及數量變化，關聯免疫治療響應。

免疫組化（IHC）：分析腫瘤組織中CD206、iNOS、CD8、PD-1等標志物的表達，評估巨噬細胞極化和T細胞浸潤狀態。

影像評估：通過磁共振成像（MRI）監測肝癌患者免疫治療前后的腫瘤變化，關聯NUPR1?巨噬細胞水平與治療響應。

三、主要研究結果

1、NUPR1在HCC腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）中高表達且參與HCC進展

通過多維度分析揭示NUPR1在肝癌（HCC）腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）中的表達特征及臨床意義。scRNA-seq數據顯示，與正常肝組織相比，HCC腫瘤組織中巨噬細胞比例顯著升高，T/NK細胞比例減少。差異基因分析發現NUPR1是腫瘤與正常組織巨噬細胞的核心差異基因，且在腫瘤巨噬細胞中高表達?？缥锓N驗證顯示，小鼠HCC模型中NUPR1同樣主要在巨噬細胞中表達?？臻g轉錄組證實NUPR1與CD68在腫瘤區域共定位，且隨巨噬細胞浸潤腫瘤時間動態上調。臨床數據表明，NUPR1?巨噬細胞特征基因在腫瘤組織中富集，其高表達與HCC患者更低的總生存率、更高的復發率顯著相關，是術后預后的獨立預測因子。且僅巨噬細胞中NUPR1表達與預后相關，整體NUPR1表達分層無顯著差異，強調其細胞特異性作用。結果明確了NUPR1在HCC TAMs中特異性高表達的特征，并證實其作為不良預后標志物的臨床價值。

圖1、NUPR1在HCC TAMs中高表達

2、NUPR1對巨噬細胞表型及功能的調控作用

通過對NUPR1高/低表達巨噬細胞的分析，發現NUPR1高表達巨噬細胞富集免疫抑制通路，而低表達組富集免疫激活通路。表型上，NUPR1高表達巨噬細胞呈M2型特征（高表達ARG1、TREM2等），并高表達PD-L1、SIRPA等免疫檢查點；低表達組則呈M1型特征（高表達 CD80、IL1B等）。NUPR1抑制劑TFP-2HCL處理后，THP1細胞和BMDMs的M1標志物（iNOS、CD86）表達升高，M2 標志物（CD206、ARG1）表達降低，巨噬細胞形態從M2 樣紡錘形轉向M1樣圓形。臨床樣本mIF染色顯示腫瘤組織中NUPR1?CD68?細胞更多，且其低表達患者預后更好，證實NUPR1在巨噬細胞極化及預后中的關鍵作用。

圖2、NUPR1在巨噬細胞中維持免疫抑制表型

3、NUPR1通過抑制MAPK通路調控巨噬細胞表型轉換的機制

基因集富集分析（GSEA）顯示，NUPR1低表達巨噬細胞中MAPK信號通路顯著富集，其通路評分顯著高于NUPR1高表達組。UMAP可視化進一步證實，NUPR1高表達區域對應更低的MAPK通路活性，且NUPR1表達與MAPK通路評分呈顯著負相關。KEGG分析顯示，NUPR1抑制劑TFP-2HCL處理的THP1細胞中MAPK通路顯著激活，ssGSEA驗證其通路評分升高。Western blot結果表明，TFP-2HCL處理或NUPR1敲低后，THP1細胞和骨髓來源巨噬細胞（BMDMs）中ERK和JNK磷酸化水平顯著增加，但p38磷酸化無明顯變化。功能實驗顯示，TFP-2HCL可誘導巨噬細胞從M2型向M1型極化，而ERK抑制劑（FR180204）或JNK抑制劑（JNK-IN-8）可逆轉這一效應。研究結果證實NUPR1通過抑制ERK和JNK磷酸化抑制MAPK通路，進而維持巨噬細胞的免疫抑制表型，而靶向NUPR1可激活ERK/JNK通路，促進M1型極化。

圖3、NUPR1通過ERK和JNK通路促進巨噬細胞表型轉換

4、NUPR1?巨噬細胞對 CD8?T 細胞功能的影響及機制

scRNA-seq分析顯示，NUPR1高/低表達組的T/NK細胞比例無顯著差異，但基因表達特征不同：NUPR1高表達組中CD8?T細胞的細胞毒性基因低表達，耗竭基因高表達；低表達組則progenitor耗竭基因富集。signature評分顯示，NUPR1高表達組CD8?T細胞耗竭評分升高，細胞毒性和progenitor耗竭評分降低。TCGA數據證實，NUPR1?巨噬細胞與耗竭CD8?T細胞呈強正相關。共培養實驗中，TFP-2HCL處理的巨噬細胞可上調CD8?T細胞的IFN-γ、Gzmb表達，減少PD-1表達，逆轉T細胞耗竭。而加入ERK抑制劑（FR180204）或JNK 抑制劑（JNK-IN-8）后，TFP-2HCL對CD8?T細胞的調控作用被消除。NUPR1?巨噬細胞通過抑制ERK/JNK通路促進CD8?T細胞耗竭，靶向NUPR1可通過激活該通路改善T細胞功能。

圖4、巨噬細胞中的NUPR1通過ERK和JNK通路促進耗竭性CD8+ T細胞的耗竭

5、靶向NUPR1對肝癌（HCC）的治療效果及與PD-1抑制劑的協同作用

在Hepa1-6皮下移植瘤模型中，NUPR1抑制劑TFP-2HCL處理顯著縮小腫瘤體積、降低重量，腫瘤組織中M2標志物CD206減少，M1標志物iNOS增加，CD8?T細胞浸潤增多且 PD-1表達降低。hydrodynamic尾靜脈注射誘導的自發性原位肝癌模型中，TFP-2HCL同樣顯著減輕肝臟腫瘤負荷，IHC染色顯示類似的免疫微環境改善。聯合治療實驗中，TFP-2HCL 與抗PD-1抗體聯用較單藥更有效抑制腫瘤生長，促進巨噬細胞M1極化，增加IFN-γ?、Gzmb?CD8?T細胞，減少PD-1?CD8?T細胞。

低神經毒性的NUPR1抑制劑ZZW-115-2HCL單藥或與PD-1抑制劑聯用，在自發性模型中也顯著增強抗腫瘤效率。巨噬細胞轉移實驗證實，TFP-2HCL預處理的巨噬細胞可抑制腫瘤生長。結果表明，靶向 NUPR1能重塑免疫微環境，與PD-1抑制劑協同增強HCC治療效果。

圖5、抑制NUPR1可增強抗PD-1治療在HCC中的體內療效

6、腫瘤來源乳酸通過組蛋白乳酸化上調巨噬細胞NUPR1的機制。

Western blot 顯示，與腫瘤條件培養基（TCM）共培養后，THP1細胞和骨髓來源巨噬細胞（BMDMs）中 NUPR1 表達顯著升高，且乳酸處理可濃度依賴性增強NUPR1表達。GSE149614 數據集分析顯示，NUPR1高表達巨噬細胞對應的腫瘤細胞 glycolysis評分更高，糖酵解相關基因表達上調。TCGA數據證實，NUPR1?巨噬細胞與乳酸轉運體SLC16A3呈強正相關。機制上，TCM或乳酸處理可增加巨噬細胞中組蛋白H3K18乳酸化水平，同時抑制 ERK和JNK磷酸化。代謝干預實驗顯示，腫瘤細胞經糖酵解抑制劑（Oxamate、2-DG）處理后，其條件培養基誘導 NUPR1表達的能力減弱；而糖酵解促進劑Rotenone則增強該效應。ChIP-qPCR證實，TCM或乳酸可通過H3K18乳酸化富集NUPR1啟動子區域，激活其轉錄。綜上，腫瘤細胞分泌的乳酸通過組蛋白H3K18乳酸化上調巨噬細胞NUPR1表達，抑制ERK/JNK通路。

圖6、腫瘤細胞通過H3K18賴氨酸促進巨噬細胞中NUPR1的表達。

7、NUPR1?巨噬細胞與免疫治療耐藥的關聯

MRI影像顯示HCC患者PD-1單抗治療的響應差異。mIF染色及量化分析表明，非響應者（42 例）腫瘤中NUPR1?CD68?細胞數量顯著高于響應者（33 例），且非響應者中CD68?CD206?NUPR1?（M2型）細胞比例更高。Kaplan-Meier曲線顯示，高NUPR1?CD68?水平的HCC患者總生存期更短?？绨┓N分析發現，NSCLC和黑色素瘤中NUPR1主要表達于巨噬細胞，非響應者中其表達顯著升高。多數據集驗證顯示NUPR1?巨噬細胞高表達與耐藥及不良預后相關，結果表明，乳酸通過H3K18乳酸化上調NUPR1并導致免疫抑制。

圖7、NUPR1+巨噬細胞介導對免疫療法的抗性

四、全文結論

本研究揭示，核蛋白 1（NUPR1）在肝細胞癌（HCC）腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）中扮演關鍵角色。NUPR1在TAMs中高表達，與患者不良預后緊密相關，其可促進M2巨噬細胞極化，上調免疫檢查點分子如PD-L1和SIRPA的表達，進而抑制CD8?T細胞功能，營造免疫抑制性腫瘤微環境，降低PD-1阻斷治療的響應率。機制上，腫瘤來源的乳酸誘導組蛋白 H3K18乳酸化，上調NUPR1轉錄，NUPR1則通過抑制 ERK 和JNK信號通路發揮免疫抑制作用。通過藥理學手段抑制NUPR1，可有效逆轉M2極化，增強CD8?T細胞功能。在臨床前模型中，抑制NUPR1與PD-1單抗聯合使用，顯著抑制腫瘤生長。此外，NUPR1?TAMs可作為預測免疫治療響應的生物標志物，為HCC免疫治療耐藥問題提供了新的解決思路，NUPR1有望成為提升HCC免疫治療療效的潛在靶點。

參考文獻：

Cai J, Zhang P, Cai Y, Zhu G, Chen S, Song L, Du J, Wang B, Dai W, Zhou J, Fan J, Yu Y, Dai Z. Lactylation-Driven NUPR1 Promotes Immunosuppression of Tumor-Infiltrating Macrophages in Hepatocellular Carcinoma. Adv Sci (Weinh). 2025 May;12(20): e2413095. doi: 10.1002/advs.202413095. Epub 2025 Apr 30. PMID: 40305758; PMCID: PMC12120759.